Génomique analytique et translationnelle

Ce sont des lignes directrices pour les chercheurs qui envisagent d'utiliser les services de séquençage de nouvelle génération (NGS) de la ressource partagée ATG. Tous les chercheurs sont invités à consulter le personnel de l'ATG avant de commencer à préparer ou à analyser des échantillons. Nous pouvons vous assister dans la conception expérimentale et, si nécessaire, vous mettre en contact avec des biostatisticiens experts qui peuvent vous aider dans la conception expérimentale. Il est très important de considérer la conception expérimentale avant de commencer les expériences NGS, qui peuvent être assez coûteuses.

L'ARN-seq peut être réalisé avec succès avec de très petites quantités d'ARN. Cependant, la quantité requise dépend de la "profondeur de lecture" requise et s'il y aura une contamination par l'ARN ribosomique. L'ARN ribosomique représente 90% de l'ARN dans les cellules, il est donc nécessaire d'éliminer ou de réduire l'ARN ribosomique avant d'effectuer RNA-seq. Les deux manières de procéder sont l'élimination physique, par « Ribodepletion », dans laquelle des sondes biotinylées complémentaires aux ARN ribosomiques sont hybridées avec les échantillons d'ARN, puis les complexes sont capturés et éliminés. Alternativement, une méthode de préparation de bibliothèque poly-A-dirigée (par exemple Smart-Seq) peut être utilisée qui évite le séquençage de l'ARN ribosomique, mais qui exclut les autres ARN qui manquent de queues polyA et qui pourraient être intéressants (par exemple, les microARN). Veuillez contacter le personnel des ressources partagées ATG pour discuter des options avant de commencer les expériences.

La ressource partagée ATG effectue une analyse NGS à service complet. Cependant, en raison de la complexité de la préparation de la bibliothèque NGS, ce que l'ATG peut fournir dépend du type d'expérience. Pour le séquençage ciblé du panel et le séquençage de l'exome, nous n'avons besoin que d'échantillons d'ADN et nous produirons les bibliothèques, effectuerons le séquençage et l'analyse initiale. Nous vous fournirons un devis pour le coût prévu avant de commencer les travaux. Pour RNA-seq et d'autres approches, il existe de nombreuses variations dans la manière dont les bibliothèques peuvent être construites. Nous invitons les utilisateurs à contacter le personnel ATG pour discuter des options avant de commencer. Outre le système complet Affymetrix, la ressource partagée ATG dispose d'un spectromètre Nanodrop pour quantifier l'ARN en petits volumes et d'un bioanalyseur Agilent pour analyser rapidement la qualité et la quantité d'échantillons d'ARN ou d'ADN.

Les expériences NGS peuvent être coûteuses. Le coût total de la plupart des grandes expériences (séquençage de l'exome, RNA-seq, etc.) est de 500 $ à 800 $ par échantillon, plus des frais pour la bioinformatique. Certaines expériences de séquençage ciblé plus petites coûtent moins cher par échantillon. Veuillez contacter le personnel pour plus d'informations et pour obtenir un devis.

Oui! Les expériences NGS génèrent des ensembles de données volumineux et complexes. L'analyse bioinformatique n'est pas possible sans doublons. Les triples sont meilleurs. Les réplicats sont vraiment nécessaires pour obtenir de bons résultats qui sont significatifs et qui en valent le coût.

La ressource partagée ATG suit des directives strictes de contrôle de la qualité et des procédures opérationnelles standard pour s'assurer que les données sont de la plus haute qualité et respectent ou dépassent les normes fixées par des groupes tels que le consortium ENCODE. Nous utilisons des contrôles de pointe standard pour surveiller les processus internes et effectuer des contrôles de qualité à chaque étape de la production et du séquençage de la bibliothèque. Veuillez contacter le personnel d'ATG pour voir des exemples de données que nous avons produites avec succès.

La qualité des échantillons d'ARN de départ sera confirmée à l'aide du BioAnalyzer Agilent ou par PCR en temps réel. Les bibliothèques seront également vérifiées avant le séquençage. Des contrôles de pointe sont ajoutés à plusieurs étapes pour surveiller le contrôle de qualité interne.

Les tests NGS produisent des ensembles de données volumineux et complexes qui contiennent d'énormes quantités d'informations, mais peuvent également être difficiles à analyser. La ressource partagée ATG fournit le premier niveau d'analyse, y compris l'analyse des paramètres de contrôle de la qualité, l'alignement des lectures sur le génome approprié, l'identification des variantes de séquence ou le nombre de caractéristiques, le cas échéant, et l'exécution de types simples d'interprétation, tels que la production de cartes thermiques pour ARN-seq. Cependant, des types d'analyse de données plus complexes, tels que la corrélation des résultats avec les informations du patient, doivent être effectués avec la contribution d'experts de la ressource partagée de bioinformatique ou de la ressource partagée de biostatistique. Le personnel ATG peut aider à mettre en place des interactions avec les experts appropriés, qui devraient être impliqués dès le début pour aider à la conception expérimentale et au contrôle qualité.

Il est possible que le processus complexe impliqué dans la génération de données NGS produise un "effet jour" ou "effet lot", dans lequel les échantillons traités ou analysés sur les mêmes données se regroupent. Il s'agit d'un artefact bien connu de l'analyse de données de grande dimension, et nous incluons des contrôles de pointe pour nous aider à identifier et à supprimer ces types de problèmes de données.

La ressource partagée ATG dispose d'une équipe d'experts en bioinformatique qui effectuera l'analyse initiale des données et qui gérera et sauvegardera les données. Ils peuvent effectuer les types d'analyses les plus simples (par exemple, l'expression génique à partir de RNA-seq). Cependant, les types d'analyses complexes ou personnalisés nécessiteront la contribution d'experts supplémentaires des ressources partagées en biostatistique ou en bioinformatique. Le personnel d'ATG peut aider à mettre en place les collaborations nécessaires.

La vérification est une partie importante de chaque expérience NGS, et les exigences varient en fonction du type d'expérience. Veuillez contacter le personnel ATG pour discuter des options de vérification des résultats NGS.

Le directeur de l'établissement, Scott A. Ness, Ph.D.., peut fournir des lettres de soutien et des conseils sur la façon de décrire la ressource partagée ATG et les expériences NGS potentielles dans les demandes de subvention. Le Dr Ness a fait partie de nombreuses sections d'études du NIH, de l'ACS et du DOD et a examiné de nombreuses demandes de subventions qui incluent des expériences NGS. Ses propres subventions financées contiennent des expériences NGS. Il peut vous aider à rédiger les sections de votre subvention concernant les expériences NGS et peut signaler les pièges potentiels et les choses à éviter.

La façon la plus simple de critiquer une expérience NGS est de la décrire comme une expédition de pêche. Voici certaines choses que vous devriez absolument éviter.

1. Ne proposez pas de caractériser des gènes que vous n'avez pas encore identifiés. Si vous n'avez pas de données préliminaires, vous ne savez pas quels gènes ou combien de gènes vous allez trouver. Cependant, ils se compteront probablement par centaines. Dire simplement que vous choisirez des gènes intéressants à étudier est un moyen rapide d'obtenir un mauvais score sur votre subvention. Si possible, votre expérience doit tester une hypothèse. Par exemple, vous pourriez faire l'hypothèse que certains gènes (par exemple les gènes de l'apoptose) seront induits. Ensuite, vous pouvez proposer d'utiliser des tests NGS pour tester cela (et proposer une PCR en temps réel comme approche de secours). De cette façon, vous pouvez tester une hypothèse, proposer des résultats attendus et des contrôles (par exemple des gènes qui devraient monter et descendre), ce qui est une bien meilleure façon de faire une expérience NGS (ou toute autre expérience). Aller simplement à la pêche aux gènes est une mauvaise approche et attire toujours la colère du comité d'examen.
2. Dire simplement que vous utiliserez un logiciel pour analyser les données ou regrouper les gènes en voies va également vous attirer des ennuis. Les données NGS peuvent être extrêmement complexes et nécessiteront des méthodes statistiques d'analyse. Les données sur les voies connues sont terriblement incomplètes. De toute façon, la plupart des gènes ne sont pas dans les voies. Vous aurez besoin d'une approche bien planifiée pour analyser les données. Vous devriez avoir un moyen de savoir si l'expérience a fonctionné ou non (par exemple, les gènes d'apoptose attendus ont-ils été activés ?).
3. L'expérience NGS ne doit pas être simplement un paragraphe à la fin de l'un de vos objectifs. Quoi que vous fassiez, n'ajoutez absolument pas une expérience NGS à la fin d'une demande de subvention comme quelque chose que vous « ferez également ». Les expériences NGS sont grandes, coûteuses et compliquées et elles ne peuvent pas être réalisées après coup. Beaucoup, beaucoup de subventions ont une description d'un paragraphe d'une expérience NGS que les chercheurs feront également. C'est un paratonnerre pour les critiques des critiques.
4. Si vous recherchez des gènes, vous devriez les rechercher pour une raison. Ne vous contentez pas de proposer de rechercher des gènes régulés sans proposer d'en faire quelque chose. Trouver les gènes qui montent et descendent n'est pas un objectif assez important. Vous devez rechercher des gènes dans un but précis (par exemple, une hypothèse à tester).